【一起学】农杆菌浸花法如何转化拟南芥?-自主发布-资讯-生物在线

【一起学】农杆菌浸花法如何转化拟南芥?

作者:北京安必奇生物科技有限公司 2020-03-19T11:16 (访问量:29567)

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以下是蘸花法的protocol(徐远涛,徐强 2018):
材料与试剂
培养钵、保鲜膜、营养土 (泥炭土:蛭石:牛粪=1:1:1)、带有目的基因载体的农杆菌菌株、苗龄5周左右的拟南芥植株、蔗糖、Silwet-77、含抗生素的LB培养基VB
仪器设备
剪刀、生长室、震荡培养箱、离心机、分光光度计
实验步骤
  1. 长日照 (光照16 h、黑暗8 h) 环境下种植健壮的拟南芥植株 (约5周)。
  2. 剪掉最开始抽出的1-5 cm长的初生主花序 (促进长出更多的侧生花序)。修剪后一个星期内进行渗透转化 (一般3~5 d)。并且在渗透转化的前1 d植株需充分浇水,以便植物气孔在转化时充分张开。
  3. 准备农杆菌液。通常先用1 ml 含抗生素的LB培养基培养已经转化了目的表达载体的农杆菌液,然后再吸取150 μl培养过夜的菌液加入到150 ml 新鲜的液体LB培养基中28 °C环境下震荡培养24 h。
  4. 4,000 x g,20 min离心菌液,然后将菌重悬于120 ml渗透液 (10%蔗糖 + 400 μl/L Silwet-77,蘸花前充分混匀,OD600=0.8-1.0) 中。与此同时,剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花。
  5. 将植株的地上部分浸入菌液中1 min,轻微震荡。
  6. 用保鲜膜将侵染过的植株罩起来以保持湿度,暗培养1 d,然后置于正常培养条件,2~3 d后可去掉保鲜膜,转化后1周左右方可浇水,并定期继续侵染几次。
  7. 继续培养至植物成熟,收种子放在干燥环境中1周左右,即可筛选转化子。
注意事项
  1. 在去除初生花序后,次生花序约2-10 cm时最适宜侵染。因为此时有许多可用来侵染的花蕾。
  2. 渗透液浓度在0.15~1.74之间时,转化率没有明显变化。
  3. Silwet L-77浓度在0.02%~0.1%时,转化率是0.005%时的10-20倍,故一般采用的浓度为0.05%。但是,值得注意的是利用高浓度的Silwet L-77进行侵染时,在某些环境下会导致植物组织坏死。

服务推荐:

北京安必奇基于专业的的拟南芥遗传转化平台,提供多种拟南芥生态型的转化,有多种载体和选择标记可选。我们一直在努力为客户提供更好的服务,以满足不同研究需求。
如有任何相关的问题,请您联系我们的工作人员,我们尽快为您解答和服务!

详情点击:https://www.abace-biology.com/arabidopsis-thaliana.htm
参考文献
1. 徐远涛 , 徐强 . (2018). 拟南芥蘸花侵染. Bio-101: e1010203. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010203.
, 拟南芥作为模式生物,具有很多其他常见植物无法比拟的优势:
1.基因组较小,大约包含1.57亿个碱基,仅为小麦的1/80,只含有5对同源染色体。小的基因组规模为尽早地全基因组诠释提供了便利,蛋白组学也有很大进展。
2.植株小,环境适应能力强,方便人工规模化培养;

3. 生活周期短,繁殖能力强,节省实验周期。
4. 严格的闭花自花传粉,基因高度纯合,能保留基因突变和其他遗传特征。
5. 很强的可诱变性,可通过物理手段(X-Ray和慢中子)和化学手段(EMS,生物的T-DNA插入等)进行较高突变率地人工诱变。。
6. 分布广,种质资源丰富。大量的野生突变体和超过300 000个独立的T-DNA插入株可通过T-DNA database网站查阅。
7. 整个幼苗以及成苗的根呈现半透明,方便光学显微镜进行直观研究。


拟南芥转基因技术

目前,拟南芥转基因技术主要是利用农杆菌介导的转化。该方法简单,不需要经过复杂、技术含量要求高的组织培养和重新诱导分化,即可直接获得转基因植物,为植物基因功能、遗传发育和生理代谢研究提供便利。拟南芥转基因的原理是将目的基因以及相关元件插入载体比如pCAMBIA系列pPZP系列等。具体构建方法同一般的质粒构建构建好的质粒在大肠杆菌中进行扩增制备,再通过化学转化或电击法将载体转入农杆菌GV3101菌株的感受态细胞中。菌株带有庆大霉素(Gent)和利福平(Rif)抗性而载体携带卡那霉素(Kan)抗性基因,经三种抗生素共同抗性筛选去除大肠杆菌和转化的农杆菌。再利用PCR或酶切鉴定得到阳性农杆菌克隆。
拟南芥蘸花法示意图。
浸花法(floral dip method)(Clough等,1998)是农杆菌介导拟南芥遗传转化的一种常用方法。用于转化的植株需培养4~5周,直到其抽苔开花,转化前去除果荚和已授粉的花,提高转化的阳性率。将拟南芥的花序放到含有农杆菌的转化介质中浸泡3~5分钟农杆菌可以穿过植物细胞壁和质膜,侵染胚囊,将带有目的基因和元件的T-DN**段整合到雌配子的基因组上完成转化
以下是蘸花法的protocol(徐远涛,徐强 2018):

材料与试剂
培养钵、保鲜膜、营养土 (泥炭土:蛭石:牛粪=1:1:1)、带有目的基因载体的农杆菌菌株、苗龄5周左右的拟南芥植株、蔗糖、Silwet-77、含抗生素的LB培养基VB
仪器设备
剪刀、生长室、震荡培养箱、离心机、分光光度计
实验步骤
  1. 长日照 (光照16 h、黑暗8 h) 环境下种植健壮的拟南芥植株 (约5周)。
  2. 剪掉最开始抽出的1-5 cm长的初生主花序 (促进长出更多的侧生花序)。修剪后一个星期内进行渗透转化 (一般3~5 d)。并且在渗透转化的前1 d植株需充分浇水,以便植物气孔在转化时充分张开。
  3. 准备农杆菌液。通常先用1 ml 含抗生素的LB培养基培养已经转化了目的表达载体的农杆菌液,然后再吸取150 μl培养过夜的菌液加入到150 ml 新鲜的液体LB培养基中28 °C环境下震荡培养24 h。
  4. 4,000 x g,20 min离心菌液,然后将菌重悬于120 ml渗透液 (10%蔗糖 + 400 μl/L Silwet-77,蘸花前充分混匀,OD600=0.8-1.0) 中。与此同时,剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花。
  5. 将植株的地上部分浸入菌液中1 min,轻微震荡。
  6. 用保鲜膜将侵染过的植株罩起来以保持湿度,暗培养1 d,然后置于正常培养条件,2~3 d后可去掉保鲜膜,转化后1周左右方可浇水,并定期继续侵染几次。
  7. 继续培养至植物成熟,收种子放在干燥环境中1周左右,即可筛选转化子。
注意事项
  1. 在去除初生花序后,次生花序约2-10 cm时最适宜侵染。因为此时有许多可用来侵染的花蕾。
  2. 渗透液浓度在0.15~1.74之间时,转化率没有明显变化。
  3. Silwet L-77浓度在0.02%~0.1%时,转化率是0.005%时的10-20倍,故一般采用的浓度为0.05%。但是,值得注意的是利用高浓度的Silwet L-77进行侵染时,在某些环境下会导致植物组织坏死。

服务推荐:

北京安必奇基于专业的的拟南芥遗传转化平台,提供多种拟南芥生态型的转化,有多种载体和选择标记可选。我们一直在努力为客户提供更好的服务,以满足不同研究需求。
如有任何相关的问题,请您联系我们的工作人员,我们尽快为您解答和服务!

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参考文献
1. 徐远涛 , 徐强 . (2018). 拟南芥蘸花侵染. Bio-101: e1010203. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010203.
2. https://lt.cjdby.net/thread-1250501-1-1.html拟南芥作为模式生物,具有很多其他常见植物无法比拟的优势:
1.基因组较小,大约包含1.57亿个碱基,仅为小麦的1/80,只含有5对同源染色体。小的基因组规模为尽早地全基因组诠释提供了便利,蛋白组学也有很大进展。
2.植株小,环境适应能力强,方便人工规模化培养;

3. 生活周期短,繁殖能力强,节省实验周期。
4. 严格的闭花自花传粉,基因高度纯合,能保留基因突变和其他遗传特征。
5. 很强的可诱变性,可通过物理手段(X-Ray和慢中子)和化学手段(EMS,生物的T-DNA插入等)进行较高突变率地人工诱变。。
6. 分布广,种质资源丰富。大量的野生突变体和超过300 000个独立的T-DNA插入株可通过T-DNA database网站查阅。
7. 整个幼苗以及成苗的根呈现半透明,方便光学显微镜进行直观研究。


拟南芥转基因技术

目前,拟南芥转基因技术主要是利用农杆菌介导的转化。该方法简单,不需要经过复杂、技术含量要求高的组织培养和重新诱导分化,即可直接获得转基因植物,为植物基因功能、遗传发育和生理代谢研究提供便利。拟南芥转基因的原理是将目的基因以及相关元件插入载体比如pCAMBIA系列pPZP系列等。具体构建方法同一般的质粒构建构建好的质粒在大肠杆菌中进行扩增制备,再通过化学转化或电击法将载体转入农杆菌GV3101菌株的感受态细胞中。菌株带有庆大霉素(Gent)和利福平(Rif)抗性而载体携带卡那霉素(Kan)抗性基因,经三种抗生素共同抗性筛选去除大肠杆菌和转化的农杆菌。再利用PCR或酶切鉴定得到阳性农杆菌克隆。
拟南芥蘸花法示意图。
浸花法(floral dip method)(Clough等,1998)是农杆菌介导拟南芥遗传转化的一种常用方法。用于转化的植株需培养4~5周,直到其抽苔开花,转化前去除果荚和已授粉的花,提高转化的阳性率。将拟南芥的花序放到含有农杆菌的转化介质中浸泡3~5分钟农杆菌可以穿过植物细胞壁和质膜,侵染胚囊,将带有目的基因和元件的T-DN**段整合到雌配子的基因组上完成转化
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