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体外转录mRNA序列表征新方法

作者:苏州金唯智生物科技有限公司 2022-05-20T10:54 (访问量:4553)

仲春将至,新冠疫情的阴霾却仍在继续,德尔塔(Delta)、奥密克戎(Omicron)这些变异株可谓是一波不平一波又起。而值得庆幸的是,疫苗接种大大抑制了疫情的传播速度,也是由于新冠疫情的爆发,大大加快了mRNA疫苗的发展。

mRNA疫苗相比于传统疫苗具有免疫原性强、安全性高且易研发与生产等优点。伴随着体外mRNA的合成、加工、递送等技术不断地成熟,mRNA疫苗药物商业化生产的步伐在不断加快。mRNA疫苗的生产过程需要经过序列设计、合成、验证,模板线性化、体外转录,纯化,浓缩,LNP包装、纯化,过滤除菌及罐装等步骤。在以上的工艺生产过程中,需要对以下产物进行检测:

 1.加帽率;
 2.加Poly(A)尾产物长度;
 3.mRNA序列完整性、序列准确性;
 4.纯度、副反应产物;
 5.残留DNA;
 6.蛋白残留、无菌、内毒素等;

针对mRNA疫苗的研发及生产,国家药监局药审中心在2020年8月发布了《新型冠状病毒预防用疫苗研发技术指导原则(试行)》等5个指导原则的通告,其中对mRNA疫苗的生产工艺、质量特性、质量标准等进行了明确的说明。而对以上产物的检测采用的方法包括质谱法、ELISA、毛细管电泳、一代或二代测序等,其优劣势如下:


可以看到目前常规的检测方法仅仅只能检测其中某一项,为了尽可能同时检测多个mRNA质量相关指标,安升达推出mRNA序列表征新方法,即利用Pacbio三代测序技术,同时检测mRNA序列长度、序列准确性及完整性、PolyA尾长度等指标,对mRNA的序列特征、纯度、产品相关杂质等质量特性进行准确质控,为mRNA疫苗安全性提供有效保证。


方法学验证

为了验证技术流程的准确性,我们合成了不同PolyA长度(10-120nt)的RNA标准品进行测序分析,结果如下图所示,随着长度增加,polyA长度均呈现正态分布,仍保持高准确性。


图1 利用合成的不同长度polyA标准品进行方法学验证


生信分析

  1. 下机后的原始数据进行数据质量评估及数据过滤;

  2. 质控后的CCS序列与mRNA序列进行比对分析;

  3. 基于序列比对结果,进行mRNA测序深度及覆盖度分析,以评估序列完整性;

  4. 根据序列比对结果,进行序列特征分析,包括PolyA长度统计及RNA序列长度统计。


图2 生信分析流程图


结果展示

基于以上分析内容,可以获得mRNA的序列完整性、PloyA长度以及mRNA序列长度信息,结果如下:

(1)基于测序比对结果,统计mRNA长度,评估mRNA完整性


图3 mRNA序列长度统计

(2)基于测序比对结果,统计mRNAPolyA长度分布


图4 mRNA polyA长度统计

(3)基于测序比对结果,统计覆盖度、测序深度和序列变异度,评估mRNA的序列完整性和准确性


图5 mRNA完整性及准确性分析


升达服务优势

  1. 准确检测mRNA polyA尾长度分布,无偏好性

  2. mRNA polyA长度检测结果与质谱结果一致性高

  3. 同时检测mRNA polyA尾长度、序列完整性和准确性等多项指标

更多详细信息可咨询NGS.Service@azenta.com,电话400-8100-669转3。


关于安升达高通量测序


安升达配备有完整的一代、二代和三代测序平台,可为客户提供多种测序读长、通量和时间周期选择,满足生命科学研究用户对成本和速度的差异化需求。通过自主研发和合作开发,在全长转录组、全长16S分析及基因组学分析等方面形成了独特的技术优势。凭借持续的研发创新,全球化的运营管理和先进的设备平台,为科研人员在基因组学研究、精准医疗与其它应用领域的研究提供最全面的基因组学解决方案。

安升达拥有先进的高性能计算平台以及数据处理能力,采用EMCIsilon集群存储系统,拥有2PB的存储容量。携手阿里云、微软云,协同打造大数据分析的云计算能力,可快速、高效地读取高质量的测序数据,并完成精准、稳定的数据分析及交付,大幅度提高生命科学研究的速度和效率。

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Azenta(纳斯达克股票代码:AZTA)是全球**的生命科学解决方案供应商,致力于助力全球的生命科学组织更快地将重大突破性进展和疗法推向市场。Azenta 为全球业内顶尖的制药、生物技术、学术和医疗机构提供全套可靠的冷链样本管理解决方案和基因组服务,涵盖药物开发、临床研究和先进细胞疗法等领域。

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