生物素标记及效率检测试剂盒

Biotin Labeling and Efficiency Detection Kit

 选购之前客户需要根据待标记物的分子量大小和标记量选择最适宜的型号

产品介绍：

本生物素快速标记试剂盒提供了生物素快速标记所需全部试剂，用于含有伯氨基（NH2-）的蛋白/抗体/多肽或者其他大分子的标记。其反应原理如下:

产品特点：

l   使用方法简单，无需额外准备试剂；

l   节约时间，整个过程仅需 90min；

l   通过离心脱盐和去除游离的生物素，无需透析或者凝胶过滤；

l   既可用于微量标记又可大量标记，每次可标记 0.2-2mg；

l   本试剂盒对于标记好的分子可以测试生物素标记效率，避免额外购买标记效率检测试剂盒

生物素标记使用量的计算：

每个反应中生物素试剂的使用量取决于待标记蛋白质的量和浓度。例如，通过我们实验数据分析表明，标记2mg/ml 的抗体（IgG ，150KD），使用生物素和抗体的分子比为 20:1 能达到最佳效果；其他蛋白的标记可以根据实际情况，参照此比例类推。

计算公式如下：

其中：

V(µL)为生物素的体积；                           V1(mL)为待标记物（蛋白/抗体/其他含有伯胺-NH2的大分子）；

   C1(mg/mL)为待标记物的浓度；                    R 为生物素与待标记物的分子比例；

   M为待标记物的分子量（道尔顿，Dalton，Da）      C(mM)为生物素的浓度

计算示例：我们将生物素配置成10mM的浓度，用来标记1mL的2mg/mL 的抗体（IgG ，150KD），准备加入的生物素与抗体的比例为20:1，那么带入公式计算

⁶=26.66uL

实验前准备：

1.按照生物素标记使用量的计算的公式计算所需要的生物素的量。

2.提前 20min 从冰箱中取出试剂盒，使试剂盒各组分平衡至室温。

3.用助溶剂DMSO将活性生物素配制成10mM(2mg生物素加DMSO 440ul)。

 特别提示：

A.溶解的活性生物素建议一次性使用完，如使用不完可以密封放在-20℃的冰箱内，一月内可以使用，但是标记效率会降低；

B.生物素助溶剂使用完之后需要立即密封保存，防止吸潮。

操作步骤：（本操作步骤按照 1mg抗体的量进行标记）

1.   取1mg 待标记抗体于超滤管中，并加入相应体积的标记缓冲液，使抗体的终浓度为 2mg/mL，12,000 x g 离心 10min。

请注意：

A.超滤管的最大体积和最大截留分子量，本实例超滤管的最大体积为 0.5mL；

B.如果待标记抗体浓度低时，可先超滤离心浓缩；

C.如果待标记物含有游离的氨基（Tris,氨基酸或者其他干扰物，需要用标记缓冲液反复超滤确保其去除干净）

2. 加入13.3µL生物素溶液和适量标记缓冲液至上述超滤管中，使终体积为 0.5ml，并轻轻吹打混匀。放入 37℃恒温箱中避光温育 30min。

3. 12,000 x g 离心 10min。

4. 加入适量标记缓冲液至上述超滤管中，并轻轻吹打混匀，12,000 x g 离心 10min， 重复此步骤多次。

5. 收集超滤管中的溶液（即生物素标记的抗体），加入等体积保存液，-20℃保存。

生物素标记的抗体测量标记效率（微孔酶标板法）：

A.      取180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中，在500nm波长测量吸光值，记录为A_500(H-A);最好测量三次取平均值；

B.       在微孔板中加入20uL待测的生物素标记蛋白（Biotinylated Protein,简称BP），震荡或移液器吹打充分混匀后，在500nm波长测量吸光值，吸光值稳定20秒以上，记录为A_500(H-A-BP);最好测量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)< 0.3*A_500(H-A),请用PBS稀释待测样品，再次重复此步骤。

标记效率计算方法：

1）蛋白摩尔浓度计算：mM /mL

2）生物素摩尔浓度计算（微孔板法）：mM /mL

其中吸光值变化(微孔酶标板)：ΔA₅₀₀=A_500(H-A)- A_500(H-A-BP)

备注：使用标准96孔微孔板，200ul液体，其液面高度（光程）为0.58cm

4）标记摩尔比计算：

生物素：蛋白=[(生物素摩尔浓度*10)/蛋白原始摩尔浓度]*稀释倍数

注意事项：

1. 本试剂盒也可标记其它含有氨基（NH2-）的抗原、HRP、多肽，具体标记比例根据待标记物中氨基的数量确定。

2. 本试剂盒中的生物素助溶剂为DMSO ，使用完毕后要密封干燥保存。

3. 本试剂盒未开封前的有效期为18个月，请在有效期内使用;本试剂盒中的生物素加入助溶剂之后，如果使用不完，请密封放在-20℃保存，一周内可以正常使用，如果超过一周，一个月之内使用，使用里量请酌情加大；超过一个月请不要再使用。

4. 请注意试剂盒中提供的超滤管的规格和分子截流大小来确定是否适合您的最佳标记条件；

5. 在步骤 2 中，标记其它抗体时，我们最好控制抗体的终浓度为 2mg/mL，然后再根据抗体的量计算应加入活性生物素的体积。

*本试剂仅供实验室研究使用