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慢病毒的生产流程及感染细胞的步骤

作者:山东维真生物科技有限公司 2018-04-23T00:00 (访问量:15911)


 

慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体,与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比,一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用,另一方面,Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后,可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达。特点如下:

1)直接包装成为假病毒颗粒,对分裂和非分裂细胞均有感染作用,适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。

2)可以通过简单方式,在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。

3)可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。

4)无需任何转染试剂,操作简便。

5)可以根据客户需要制备多种标记。

 

慢病毒包装实验步骤

一、Day1: 10cmdish聚合度90%的HEK293T(每盘大约6x107)细胞按1:1比例传盘至15cmdish,第二天细胞达到聚合度90%-95%(每盘大约1.5x108),培养基为Gibico高糖DMEM培养基(含10%FBS)。

二、Day2:

1、转染前2-3个小时换液(含10%FBS,1mM/L不需要加入丁酸钠?加入的浓度?)
2、按照以下比例配置转染试剂:

Mix 1 体积 ul Mix 2  
DMEM(无FBS) 1000 DMEM(无FBS) 1000
PEI 190ul (1ug/ul) 目的基因质粒 25 ug
    PMD2G 7.5ug
    PSPAX2 15ug

Mix 1和Mix 2分别混合后,室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合,室温30min,加入至15cm细胞培养皿中。(细胞达到聚合度90%,细胞过少会影响转染效率)

三、Day3: 6h-24h内更换新鲜培养基(含10%FBS),观察转染效率并拍照。

四、Day5:72h观察细胞状态并拍照。收取上清培养基,过0.45um滤膜,上清培养基加入超速离心管中,配平后离心,25000r,4℃离心1.5h。弃上清,用1ml病毒保存液回溶混匀溶解过夜。

五、Day6:收集病毒分装、孔稀释测滴度。

取5ul病毒原液加入到45ulDMEM中,混匀后取5ul加入到45ulDMEM中,重复6次;分别做两组重复
病毒原液=A 45ulDMEM +5ulA=B1 45ulDMEM +5ulB=C1 45ulDMEM +5ulC=D1 45ulDMEM +5ulD=E1 45ulDMEM +5ulE=F1 45ulDMEM +5ulF=G1 45ulDMEM +5ulG=H1
病毒原液=A 45ulDMEM +5ul病毒=B2 45ulDMEM +5ulB=C2 45ulDMEM +5ulC=D2 45ulDMEM +5ulD=E2 45ulDMEM +5ulE=F2 45ulDMEM +5ulF=G2 45ulDMEM +5ulG=H2
将这7个混合液和病毒原液分别取10ul加入到96孔293细胞中( 每孔约5000个细胞),72H拍照
10ulA 10ulB1 10ulC1 10ulD1 10ulE1 10ulF1 10ulG1 10ulH1
  10ulB2 10ulC2 10ulD2 10ulE2 10ulF2 10ulG2 10ulH2
102 103 104 105 106(NE1,NE2个带荧光细胞) 107(MF1,MF2个带荧光细胞) 108 109
计算方法,对能观察到荧光的后两个孔进行计数,两组重复取平均值 [(NE1+NE2)÷10+MF1+MF2]÷4×107

 

慢病毒感染细胞的实验步骤

1、铺板:将对数生长期的细胞消化重悬后,按1*105/L密度接种于12孔板,生长过夜

2、感染:将70-80%铺满12孔板中的培养液吸除,换新鲜的培养液,同时加入PBS

 

 

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