实时荧光QPCR科普问答
天呈医流整理发布
& 问：什么是QPCR？
答：QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR。
& 问：QPCR、DNA检测、PCR之间的关系？
答：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction简称PCR）原理凭借敏感、特异、快速的特点荣获93年诺贝尔化学奖。因其在病原体检测方面的独特优势，因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快，成为分子生物学诊断的主流，至今仍处于学术和应用前沿：
第一代产品：
基因扩增热循环仪（DNA Thermal Cycler）+电泳仪+紫外分析仪+定性试剂，构成PCR定性检测。
第二代产品：
基因扩增热循环仪+荧光仪+终点定量试剂，构成PCR-DNA终点法定量检测（End-point quantitative PCR detection），又分为终点酶免定量（ End-point ELISA-PCR）和终点荧光定量（End-point Fluor-PCR）两种。
第三代产品：
实时定量QPCR仪＋实时荧光定量试剂，构成QPCR-DAN/RNA实时荧光定量检测。
& 问：相比以前的方法，QPCR有哪些特点？
答：QPCR至少有以下特点：
n 所用仪器少，只用一台仪器。
n 检测时间短，只须45分钟～1小时10分钟（试剂各异），而定性PCR须3～4小时，酶免终点定量须5～6小时，荧光终点定量须2～3小时。
n 操作极其简单：前处理后，样本插入仪器一小时后到电脑上来出报告即可，无须开盖，移样本（以前方法），避免污染。
n 结果精确：定性PCR只能定性，很粗略，终点定量PCR由于只能在40个热循环结束后检测荧光，被测荧光达到饱和导致定量不够精确，属于半定量状态。而实时荧光QPCR是在扩增的每时每刻连续检测各样本的荧光值的变化，如图一所示：
西安天隆TL
检测动态范围：100～1010 DNA copies/ml
检测精度：0.1RLU
辨别率：5000和10,000个模板拷贝样本的辨别率99.7％。
& 问：QPCR的技术先进性、价格及应用现状？
答：实时荧光QPCR是当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术，被美国FDA承认并推崇，被美国FDA批准并取得临床应用执照的QPCR试剂品种有：
HBV乙肝病毒DNA，
HCV丙肝病毒RNA，
HIV爱滋病病毒RNA，
Chlamydi trachomatis（CT），性传播疾病，沙眼衣原体，
Neiserria gonorrhea (NG)，性传播疾病，淋病双球菌，
Cytomegalovirus（CMV），性传播疾病，巨细胞病毒，
Mybobacterium tuberculosis（Mtb），呼吸道疾病，结核分支杆菌等。
实时荧光PCR仪研发技术难度大，门槛高，发达国家也只有有限几家知名公司生产，且售价昂贵：如
罗氏公司的 LightCycler 480
德国eppendorf 公司 Mastercycler ep realplex 实时荧光定量PCR仪
BIO-RAD公司 iQ5实时PCR检测系统
美国ABI 7500 Real-Time PCR System
美国ABI 7000 Sequence Detection System Spare Parts
美国ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System
以上产品价格在50万上下不等。
可见，在病人看来，哪家医院应用了QPCR技术便是先进诊断技术的象征，在发达国家也是如此。
国产仪器情况：
国产仪器生产单位不超过五家，其中包括：
日本独资杭州博日实时荧光QPCR仪（33孔）
西安天隆科技有限公司实时荧光QPCR仪（48孔）
以上产品均取得国家SFDA认证，报价均在30万以内。
国产试剂情况：
多家公司生产实时荧光QPCR试剂盒，价格与终点法试剂相当，且品种齐全，价格便宜，购买方便：
乙肝HBV-DNA，
丙肝HCV-RNA，
艾滋AIDS HIV-RNA，
性病系列：淋病双球菌NG， 沙眼衣原体CT，
解脲支原体UU， 疱疹病毒HSV，
人体乳头瘤HPV，
优生优育系列：巨细胞病毒CMV，弓形虫COX等。
& 问：QPCR的应用领域
答：QPCR主要应用在医疗检验、疾病防控、食品安全、农业、林业、畜牧养殖、水产养殖、分子生物、法医鉴定、科研探究等诸多领域。
据不完全统计相关国家标准强制要用QPCR仪进行检测：
《2004GB/T 194380.1-禽流感病毒通用荧光 RT-PCR检测方法》
《SN/T 1632.3-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法：荧光PCR方法》
《SN/T 1870-2007 食品中致病菌检测方法：实时PCR法》
《GBT 21105-2007 动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法 PCR方方法》
《GBT 21102-2007 动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法 实时荧光PCR方法》
《GBT 19915.8-2005 猪链球菌2型毒力因子荧光PCR检测方法》
《GBT 19495.4-2004 转基因产品检测 核酸定性PCR检测方法》
《SNT 1686-2005 新城疫病毒中强毒株检测方法 荧光RT-PCR法》
《SN 0169-1992 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》