随着高通量测序的发展，lncRNA的研究热度一直居高不下，大量lncRNA得到注释，其通过在转录、转录后水平及表观遗传方式调控基因的表达，参与机体的生长发育过程。
如NEAT1-1 m6A通过上调Pol II磷酸化促进肿瘤的发生转移1；GATA6-AS1可作为调节因子影响GATA6的表达，参与内胚层的分化过程2。而对于刚接触lncRNA的科研小白，要想研究其功能及调控机制，需要了解以下2个关键点。
一、lncRNA的敲除和过表达
研究lncRNA对下游靶基因的调控机制时，一定少不了对lncRNA进行敲低、敲除和过表达。敲低lncRNA最常用的做法是利用RNAi降解RNA，实现转录后水平的沉默，降低表达水平。如果要在体内敲低某lncRNA时，只需将包装好的含shRNA序列的病毒感染目的细胞，即可实现lncRNA的敲低3，这种方式对编码和非编码基因都适用。
而对于lncRNA的敲除，可以通过Cre-loxp和CRISPR-Cas9 2种系统在基因组水平上编辑实现。Cre-loxp是一种重组酶系统，Cre重组酶能够特异性识别loxp位点，并将2个loxp位点间的序列进行删除或重组（详细Cre-loxp系统介绍）。
Cre-loxp系统敲除效率高、敲除彻底，但受限于必须有构建好的Flox小鼠（基因组中目的lncRNA 2侧插入有同向的loxp位点），然后将构建好的Cre酶工具载体注射到小鼠体内，当Cre酶表达后即可删除2个loxp之间序列，实现目的基因的敲除。
CRISPR-Cas9系统包含具有核酸内切酶活性的Cas蛋白和单链sgRNA（single-guide RNA），sgRNA通过识别基因组序列，引导Cas9蛋白切割基因组，当DNA双链发生断裂后，细胞主要通过（NHEJ）非同源末端连接修复断裂口，因此会引入小片段碱基的插入。
对于编码基因，非3倍数碱基的插入会导致移码突变，实现编码基因的敲除，但这种移码突变对lncRNA达不到任何敲除效果。
要想敲除lncRNA，则需要在基因组上lncRNA上下游各设计2个sgRNA对，串联构建至Cas9载体上包装病毒，Cas9蛋白表达即可切除基因组DNA，达到lncRNA敲除的目的（Cas9系统对lncRNA敲除效率及影响敲除效率的因素详见《高效筛选低阳性比例单克隆技巧｜CRISPR/Cas9敲除LncRNA或者外显子的效率是多少？》）。
常规过表达lncRNA，只需将目的序列构建至载体中转染细胞即可实现。但对于长度超出载体容量的基因，则需要利用CRISPR-SAM系统，通过失去核酸内切酶活性的dCas9和sgRNA靶向作用，将转录激活因子P65/HSF1/VP64拉到基因启动子区，实现基因的内源性过表达。此外，saRNA技术也能上调基因的过表达（详见《有了这三项技术，90%以上的『基因过表达』可以实现》）。
二、确定lncRNA与蛋白结合的功能区
lncRNA与蛋白的互作是调控机制研究的主流。由于lncRNA长度大于200nt，它不像miRNA一样可以通过种子区调节靶基因的表达。所以，确定lncRNA的功能区域是研究RNA-蛋白互作机制的要点。
在2020年Genome Biology发表的“A novel antiviral lncRNA EDAL shields a T309 O-GlcNAcylation site to promote EZH2 degradation”文章中，lncRNA EDAL通过抑制组蛋白甲基转移酶EZH2 T309位的O-GlcNAc糖基化，使EZH2降解并抑制狂犬病毒的复制4。该作者研究EDAL功能区及其在EZH2上作用位点的方法值得大家借鉴。
为了研究EDAL的功能区，作者将RNAstructure 5.3预测到的EDAL二级结构分4个小区段验证（A），结果发现EDAL–1(1-304nt)能够降解EZH2，并降低病毒滴度(B)。
接着缺失EDAL–1不同区段进行过表达，发现只有98-153nt组产生同样结果。进一步将该段构建至其他lncRNA 3’端进行相同实验，同样也降低了EZH2表达，因此作者确定了EDAL-1是诱导EZH2降解的关键功能区。
为了进一步验证EDAL与EZH2的作用位点，作者突变了影响EZH2稳定性的磷酸化和O-GlcNAc位点，通过一一排除并结合pull-down、WB等验证出EDAL通过与EZH2 T309 O-GlcNAc位点作用，促进EZH2降解。
由于生物分子的功能与结构是密切相关的，像该文中作者将lncRNA根据二级结构截短、缺失并进行过表达验证，无疑是确定lncRNA功能区段的。同时，也可以结合RNA-pull down及RIP技术，通过对形成的RNA-蛋白复合物分离、纯化及检测，最终证实lncRNA与蛋白的互作。
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参考文献…
1. Wen S, et al. Long non-coding RNA NEAT1 promotes bone metastasis of prostate cancer through N6-methyladenosine. Molecular Cancer, 2020(171)
2. Yang et al., GATA6-AS1 Regulates GATA6 Expression to Modulate Human Endoderm Differentiation. Stem Cell Reports, 2020
3. Zhu B L, et al. MMP13 inhibition rescues cognitive decline in Alzheimer transgenic mice via BACE1 regulation. Brain, 2019, 142(1): 176–192
4. Sui B, et al. A novel antiviral lncRNA EDAL shields a T309 O-GlcNAcylation site to promote EZH2 degradation. Genome Biology, 2020, 21(1): 228