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WB整体解决方案

作者:北京索莱宝科技有限公司--实验室产品 2018-08-10T00:00 (访问量:7198)

蛋白电泳
SDS-PAGE及Western blot

蛋白电泳 SDS-PAGE原理

SDS是一种阴离子表面活性剂,能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷,掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此,各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率,不再受原有电荷和分子形状的影响,而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAGE)。实验使用过程中,还加入DTT或者巯基乙醇,以打开蛋白间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构。SDS—PAGE最常采用垂直板不连续系统(分离胶与浓缩胶)。

一、样品制备
 
注:本系列蛋白提取试剂所提取的蛋白由于含有去污剂,所以不适合于Bradford蛋白浓度测定试剂盒,请选择BCA法或者Lowry法。
产品货号 产品名称 说明
R0010 高效RIPA组织/细胞裂解液 在普通RIPA的基础上改进而来,含蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂(配有一支PMSF)
R0020 RIPA组织/细胞裂解液 RIPA经典配方,适于绝大多数蛋白-蛋白相互作用的免疫实验。组成: 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS.(配有一支PMSF) 保存: 4 ºC避光
R0030 非变性组织/细胞裂解液 非变性条件下裂解的蛋白产物最大限度地保留了蛋白的特性和功能,如抗原-抗体结合或酶学活性,因此适宜于进行免疫共沉淀。
R0050 核蛋白提取试剂盒  
BC3640 全蛋白提取试剂盒  
BC3720 植物蛋白提取试剂盒  
BC3710 全蛋白提取试剂盒(强)  
BC3711 全蛋白提取试剂盒(中)  
BC3730 磷酸化蛋白提取试剂盒  
BC3740 胞浆蛋白提取试剂盒  
蛋白含量测定是以标准蛋白作为对照,根据蛋白浓度不同,吸光值不同而达到定量的目的。有些方法是理解蛋白本身的吸光值(紫外光谱吸收法)来定量,但更多的是用染料对蛋白进行染色,利用染料与蛋白结合显出与原染料及蛋白不同的吸光值来定量的。后一种方法应用更普遍。蛋白定量方法的选择,应该考虑到蛋白结构(标准品选择)、蛋白溶液内干扰物等因素的影响。
产品货号 产品名称 组成 说明
PC0010 Bradford蛋白浓度测定试剂盒
5×G250染色液 100ml 2-8℃
BSA(5 mg/ml) 1ml -20ºC
PBS稀释液 30ml 2-8℃
干扰物质少, Tris、糖、甘油、巯基乙醇、氨、EDTA等均不干扰测定。
PC0020 BCA蛋白浓度测定试剂盒
BCA Reagent 100ml 2-8℃
Cu Reagent 3.0ml 2-8℃
BSA(5 mg/ml) 1ml -20ºC
PBS稀释液 30ml 2-8℃
BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
PC0030 Lowry法蛋白浓度测定试剂盒
Folin酚甲试剂A 200ml 2-8℃
Folin酚甲试剂B 5ml 2-8℃
Folin酚乙试剂 20ml 2-8℃
BSA(5 mg/ml) 1ml -20ºC
PBS稀释液 30ml 2-8℃
Lowry法测定较为不受脂类物质干扰,适于脂类含量较高的样品测定。也能耐受相当浓度的去垢剂如SDS。
 
SDS-PAGE如今已形成成熟的方案,实验室可根据自己的情况和习惯来选择试剂。如选择1、2、3、4、5、6、7、8、9全部试剂可自己配制。也可以选择配制好的试剂。如10、11、12、13/14、16、9、20。还可选择10、13/14、16、9、17、18、19、20。
系号 产品货号 产品名称 系号 产品货号 产品名称
1 T8060 TRIS 三羟甲基氨基甲烷 11 S1051 4XSDS-PAGE分离胶缓冲液(PH=8.8)
2 G8200 Glycine 甘氨酸 12 S1052 4XSDS-PAGE浓缩胶缓冲液(PH=6.8)
3 S8010 SDS 十二烷基硫酸钠 13 P1016 4×蛋白上样缓冲液(含β-巯基乙醇)
4 A8080 Acrylamide 丙烯酰胺 14 P1015 4×蛋白上样缓冲液(含DTT)
5 M8200 N,N-Methylene Bisacrylamide甲叉双丙烯酰胺 15 D1070 1M DTT
6 A8090 Ammonium Persulfate 过硫酸胺 16 A1030 10%过硫酸氨
7 D8220 DTT 二硫苏糖醇 17 T1020 1M Tris-HCL (PH6.8)
8 M8210 β-Mercaptoethanol β-巯基乙醇 18 T1010 1.5M Tris-HCL(PH8.8)
9 T8090 TEMED 四甲基乙二胺 19 S1010 10%SDS
10 A1010 30%丙烯酰胺(29:1) 20 T1070 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液
凝胶配制表(一)
  分离胶12% 分离胶10% 分离胶8% 浓缩胶(3%)
总体积 10ml 10ml 10ml 5ml
4X分离胶缓冲液(PH8.8) 2.5ml 2.5ml 2.5ml 0
4X浓缩胶缓冲液(PH6.8) 0 0 0 1.25ml
30%丙烯酰胺(29:1) 4ml 3.3ml 2.7ml 0.5ml
ddH2O 3.4ml 4.1ml 4.7ml 3.2ml
10%过硫酸铵 100ul 100ul 100ul 75ul
TEMED 10ul 10ul 10ul 7.5ul
凝胶配制表(二)
  分离胶12% 分离胶10% 分离胶8% 浓缩胶(3%)
总体积 10ml 10ml 10ml 5ml
30%丙烯酰胺(29:1) 4ml 3.3ml 2.7ml 0.5ml
1M Tris-HCL (PH6.8) 0 0 0 0.625ml
1.5M Tris-HCL(PH8.8) 2.5ml 2.5ml 2.5ml 0
10%SDS 100ul 100ul 100ul 50ul
ddH2O 3.3ml 4.0ml 4.6ml 3.75ml
10%过硫酸铵 100ul 100ul 100ul 75ul
TEMED 10ul 10ul 10ul 7.5ul
本公司的丙烯酰胺是29:1的,如需要定制其他规格的可以联系我们。 为了客户实验方便,我们生产的SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(P1200)和Tris- Tricine-SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒(P1320),后者主要用于小于10kd的蛋白和多肽的分离。包含了制胶的全部试剂,方便客户操作。 如果您想节省时间,也可以使用我们的预制胶,无需配胶,直接跑电泳即可。
本公司的上样缓冲液既有用于非变性的(P1017、p1027)又有变性的(P1015、P1016、P1017、P1018),有不同的稀释倍数,可以满足客户的多种实验需求。 电泳缓冲液既有用于普通的tris-甘氨酸缓冲系统的产品(T1070),又有用于Bis-tris这种系统的MOPS缓冲液(T1510) 蛋白marker有多种,非预染marker、预染marker、彩虹marker、Western Blot Marker。而且还有GE原装的变性非变性marker,广泛的分子量和用途供您选择。
产品货号 产品名称 产品货号 产品名称
P1015 4×蛋白上样缓冲液(含DTT) P1016 4×蛋白上样缓冲液(含β-巯基乙醇)
P1018 2×蛋白上样缓冲液(含DTT) P1019 2×蛋白上样缓冲液(含β-巯基乙醇)
P1017 4×非变性蛋白上样缓冲液 p1027 2×非变性蛋白上样缓冲液
T1070 5×Tris甘氨酸电泳缓冲液 T1510 Tris-Mops缓冲液(10×)
PR1300-15 次高分子量蛋白质标准 15T PR1400-20 低分子量蛋白质标准(14.4-97.4KD) 20T
PR1500-10 次高分子量蛋白质标准 10T PR1600-20 预染低分子量蛋白质(14.4-97.4KD) 20T
PR1700-10 预染次高分子量蛋白质标准 10T PR1800-10 Western Blot Marker 10T(50ul)
PR1900 预染超低分子量蛋白marker(3.3-31KD) 20T PR1910 彩虹180广谱蛋白marker 20T (100μ1)/50T(250μ1) /100T(500μ1)
PR1920 彩虹245广谱蛋白marker 20T (100μ1)/50T(250μ1) /100T(500μ1) PR1930 彩虹245plus广谱蛋白marker 20T (100μ1)/50T(250μ1) /100T(500μ1)
跑胶后的染色可以用银染或者考染的方法,如果蛋白量少,推荐使用灵敏度高一些的银染试剂盒(G7210),否则常规染色可以使用(P1305)和(P1300),其中P1300的优点是染色时间短,半小时内即可检测到蛋白电泳条带,节省了染色脱色的时间。
产品货号 产品名称
C8430 考马斯亮蓝R 250染色液
P1300 考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液
P1305 考马斯亮蓝染色套装
G7210 PAGE凝胶银染试剂盒
PG00810-S Precast-Gel预制胶 变性预制胶 10孔 8% 10片/盒
PG01010-S Precast-Gel预制胶 变性预制胶 10孔 10% 10片/盒
PG01210-S Precast-Gel预制胶 变性预制胶 10孔 12% 10片/盒
PG01510-S Precast-Gel预制胶 变性预制胶 10孔 15% 10片/盒
PG41510-S Precast-Gel预制胶 变性预制胶 10孔 4~15% 10片/盒
PG42010-S Precast-Gel预制胶 变性预制胶 10孔 4~20% 10片/盒
PG82010-S Precast-Gel预制胶 变性预制胶 10孔 8~20% 10片/盒
PG00810-N Precast-Gel预制胶 非变性预制胶 10孔 8% 10片/盒
PG01010-N Precast-Gel预制胶 非变性预制胶 10孔 10% 10片/盒
PG01210-N Precast-Gel预制胶 非变性预制胶 10孔 12% 10片/盒
PG01510-N Precast-Gel预制胶 非变性预制胶 10孔 15% 10片/盒
PG41510-N Precast-Gel预制胶 非变性预制胶 10孔 4-15% 10片/盒
PG42010-N Precast-Gel预制胶 非变性预制胶 10孔 4~20% 10片/盒
PG82010-N Precast-Gel预制胶 非变性预制胶 10孔 8~20% 10片/盒
 
Millipore和PALL公司的尼龙膜和pvdf膜,具有0.22um和0.45um两种规格。 转膜后还可以用P0012(10×丽春红)检测转膜效果,尤其是针对NC膜效果更佳。 为了节省成本和时间,您可以选择本公司的SW3020(Western Blot膜再生液)对用过的膜进行清洗,随后,可以使用不同的抗体进行下一轮Western Blot实验。 膜再生液实质是在不影响膜上结合的抗原的条件下将抗体洗脱下来,实际操作中,膜类型、抗体类型、浓度及抗原特性都影响洗脱难易度。 注意:适用于 ECL和类似的化学发光试剂进行的 Western 检测。不适用于非化学发光试剂进行的 Western检测,例如DAB,NBT/BCIP。
产品货号 产品名称
P0012 10×丽春红
SW3010 膜封闭液
A1800 抗体稀释液
A1810 一抗稀释液
A1820 HRP标记抗体稀释液
A1830 AP标记抗体稀释液
A1840 荧光抗体稀释液
T1085 1×TBST
实验操作过程中您可以针对不同的抗体选择上面合适的稀释液。
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